Algentoximeter
(© HU)
Das bbe Algentoximeter überwacht mit Hilfe einer Fluoreszensmessung die Photosyntheseaktivität von Algen, die mit dem zu untersuchenden Wasser in eine Messzelle gegeben werden. Für die Messung wird die Fluoreszenzstrahlung der Algen ausgewertet, die durch ein bestimmtes Messlicht hervorgerufen wird. Das Fluorezenssignal ist davon abhängig, inwieweit die eingestrahlte Lichtenergie während der Photosynthese "verwertet" werden kann. Wird der photo-chemische Energietransfer zum Beispiel durch Herbizide gehemmt, nimmt die Fluorezensausbeute zu. Eine Zunahme der Fluorezensintensität weist in der Regel auf eine Schädigung des Photosyntheseapparates hin und gibt somit einen Hinweis auf toxische Substanzen im Wasser.
Im Gerät wird die Wirkung der Gewässerprobe einerseits mit der Wirkung von Leitungswasser andererseits auf die Alge verglichen. Bei signifikanten Abweichungen in der Photosyntheseaktivität wird ein Alarm ausgelöst.
Der große Vorteil dieses Verfahrens ist die Möglichkeit auch Aussagen über das Ende eines Schadstoffwelle zu treffen. Denn im Gegensatz zu vielen anderen Kontinuierlichen Biotestgeräten werden bei diesem Test für jede Messung neue Organismen verwendet. Bei Geräten wie z.B. dem Daphnientoximeter können nur Angaben über den Beginn eines Ereignisses gemacht werden, weil die Tiere nach kurzer Zeit geschädigt bzw. getötet wurden und daraufhin keine weiteren Erkenntnisse liefern können.
Eine zusätzliche Funktion dieses Gerätes ist die gleichzeitige kontinuierliche Messung des Chlorophyllgehaltes im Gewässer mit einer zusätzlichen Differenzierung der Chlorophyllgehalte in vier verschiedene systematischen Algengruppen (Grünalgen, Kieselalgen, Blaualgen und Cryptophyceae), sodass eine ständige Erfassung der quantitativen Phytoplanktonentwicklung im Gewässer erfolgt.
Die Algenkultur im Toximeter
Die Zucht der Chlorella-Algen ist im Algentoximeter integriert. Sie erfolgt in einem über Fluoreszenzmessung turbidostatisch geregeltem Fermenter. Der Fermenter hält die Algen immer in der logarithmischen Wachstumsphase, damit der Anteil der aktiven Algen konstant bleibt. Eine solche Regelung dient dazu, die Konzentration der lebenden Algen konstant zu halten. Dafür wird die Konzentration der Mikroorganismen regelmäßig über Fluoreszenzmessungen ermittelt und bei Überschreitung eines festgelegten Wertes erfolgt die Beimengung einer definierten Nährlösungsmenge. Bei konstantem Volumen und konstanter Dichte der Algen sollte der tägliche Zustrom neuer Nährlösung etwa dem Volumen des Fermenters entsprechen. Eine stabile Algenzucht ist wichtig, damit die Empfindlichkeit der Algen gewährleistet ist und die Messergebnisse auch vergleichbar bleiben.
Messprinzipien des Gerätes
a) Gesamtchlorophyllgehalt
Im Küvetten - Fluorometer werden 5 LEDs verwendet, die Licht in fünf verschiedenen Wellenlängen aussenden (450 nm, 525 nm, 570 nm, 590 nm, 610 nm). Die Wasserprobe wird abwechselnd mit einer der 5 Leuchtdioden angeregt. Dabei wird jedes Mal die Fluoreszenzantwort gemessen, die bei der festen Emissionswellenlänge von 685 nm liegt. Aufgrund der Tatsache, dass Algen derselben Klasse eine ähnliche Zusammensetzung verschiedener Pigmente enthalten, ergibt sich in Wechselwirkung mit dem Chlorophyll für jede Algenklasse ein charakteristisches Fluoreszenz-spektrum. Die unterschiedlichen Algenklassen lassen sich somit über ihr spezifisches Fluoreszenzspektrum differenzieren. Es werden die Algenklassen Chlorophyceae (Grünalgen), Cyanophyceae (Blaualgen), Dinophyceae (Kieselalgen) zusammen mit Bacillariophyceae und Cryptophyceae bestimmt. Für jede Algenklasse ist ein „Fingerprint“, d.h. das typische Fluoreszenzspektrum (Fluoreszenzantwort auf Licht verschiedener Wellenlängen) dieser Algenklasse, abgespeichert. Nach jeder Messung wird dann der Gehalt der verschiedenen Algenklassen aus den jeweiligen „Fingerprints“ und dem Spektrum der Probe berechnet.
„Fingerprints“ der verschiedenen Algenklassen
(© HU)
Die Konzentration des Chlorophylls jeder Algenklasse wird in µg/l angegeben. Die Addition des Gehaltes an Chlorophyll jeder Algenklasse ergibt den Gesamtgehalt an Chlorophyll in der Probe.
b) Algenaktivität
Das Messprinzip beruht darauf, dass aktive Algen, bzw. das Photosynthese betreibende Chlorophyll, einen Teil der auf sie einwirkenden Messlichtenergie in ihr photosynthetisches System aufnehmen. Die Fluoreszenzabstrahlung fällt deshalb geringer aus als bei inaktiven bzw. toten Algen. Sind die photosynthetischen Zentren mit Lichtenergie „aufgefüllt“, wird ähnlich wie bei toten Algen proportional zum einwirkenden Messlicht Fluoreszenzlicht abgestrahlt.
Der Messzyklus beinhaltet drei aufeinander folgende Messungen, um die verschiedenen Messgrößen zu ermitteln. Die f0-, die fm- und die f-Messung
Schematische Darstellung der Messphasen
(Institut für Hygiene und Umwelt)
Während der Aktivitätsmessung findet zuerst eine Dunkeladaptation statt, um eine Standardisierung der Algen vorzunehmen. D.h, die noch in den Zellen vorhandene [Licht-]Energie wird verbraucht. Danach werden die Algen mit einem schwachen, gepulsten LED-Messlicht bestrahlt (f0-Messung). Lebende, bzw. aktive Algen werden kaum Fluoreszenzantwort zurücksenden, da sie die Lichtenergie in ihre „Lichtzentren“ aufnehmen. Nachdem die f0- Messung beendet ist, erfolgt die fm-Messung. Hier wird zum LED-Licht ein starkes Laserlicht zugeschaltet, durch welches der Lichtbedarf der Algen gesättigt wird. Innerhalb kurzer Zeit sind die photosynthetischen Zentren des Chlorophylls geschlossen, was hat zur Folge, dass die Höhe der Fluoreszenzantwort auf den Lichtimpuls stark ansteigt.
Verlauf der Fluoreszensantworten bei inaktiven bzw. geschädigten Algen
(WGMN)
Tote oder geschädigte Algen geben unabhängig vom Hintergrundlicht die gleiche „Menge“ Fluoreszenz ab, d.h. f0 und fm wären bei Proben ohne intakte Algenzellen annähernd gleich. Die Differenz zwischen dem fm und dem f0 Signal ist somit proportional zum aktiven Chlorophyllgehalt.
Verlauf der Fluoreszensantworten bei aktiven Algen
(WGMN)
Mit Hilfe des Genty-Parameters (g) lässt sich dieser Sachverhalt zusammenfassen und bietet ein Maß für die Aktivität der Algen:
g = (( fm - f0 )/ fm ) x 100 (%)
Genty Gibt die Aktivität der Algen in Prozent an, wobei je nach Algenklasse und physiologischem Zustand bis zu 75% erreicht werden. Werte um 50% sind normal.
f0 ist die gemessene Fluoreszenzabstrahlung bei geringer Lichtintensität
fm ist die gemessene Fluoreszenzabstrahlung bei zusätzlichem Hintergrundlicht
Je höher fm verglichen mit f0, desto höher ist der Wert für den Genty-Parameter und desto größer ist der Anteil an Chlorophyll aus lebenden Algen.
Die darauf folgende Messung, die f-Messung, dient der Algenkonzentrationsbestimmung. Hier wird die Probe wieder mit einem Lichtpuls ohne Hintergrundlicht angestrahlt, jedoch mit einem wesentlich stärkeren als bei der f0-Messung (Siehe oben). Die verminderte Fluoreszenzantwort durch lebende photosynthetisch aktive Algenzellen ist hier zu vernachlässigen.
Automatische Qualitätskontrolle des Algentoximeters
Einmal täglich wird vom Algentoximeter automatisch ein Kontrollversuch mit einer toxischen Lösung durchgeführt. In der Regel wird dafür eine Probe mit einem bestimmten Herbizid benutzt (3 µg/l Isoproturon). Die Höhe der Toxizität wird in Form einer Hemmung in % ausgedrückt. Die folgende Grafik (Abb. 6) zeigt ein Beispiel für die täglichen Kontrollversuche. Normalerweise ist die Aktivität der Algen in beiden Proben nach der Inkubation annähend gleich, so das eine Hemmung der Algen in der Gewässerprobe von 0 % ermittelt wird. Die rosa Linie (Inhb) in der Grafik zeigt den Verlauf der Hemmung. Die drei ersichtlichen Peaks resultieren aus den automatischen Kontrollversuchen. Die 3 µg/l Isoproturon verursachen eine Hemmung von ca. 10%. Im unteren Teil der Graphik sind die Chlorophyllgehalte der unterschiedlichen Algenklassen dargestellt.
Institut für Hygiene und Umwelt
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